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檢測微生物檢測方法和操作步驟

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檢測微生物檢測方法和操作步驟

發布日期:2020-09-07 作者: 點擊:

產品采集與樣品處理

於同一批 號的 二個運輸包裝中至少抽取 12個蕞小銷售包裝樣品,1/4樣品用於檢測,1/4樣品用於留樣,另 1/2樣品(可就地封存)必要時用於複檢。抽樣的蕞小銷售包裝不應有破裂,檢驗前不得啟開。

在100級淨化條件下用無菌方法打開用於檢測的至少 3個包裝,從每個包裝中取樣,準確稱取10g±1g樣品。剪碎後加人到200ml滅菌生理鹽水中,充分混勻,得到一個生理鹽水樣液。液體產品用原液直接做樣液。

如被檢樣品含有大量吸水樹脂材料而導致不能吸出足夠樣液時,稀釋液量可按每次 50ml遞增,直至能吸出足夠測試用樣液。在計算細菌菌落總數與真菌菌落總數時相應調整稀釋度。

B2  細菌菌落總數與初始汙染菌檢測方法

本方法適用於產品初始汙染菌與細菌菌落總數(以下統稱為細菌菌落總數)檢測。

B2.1 操作步驟

待上述生理鹽水樣液自然沉降後取上清液作菌落計數。共接種 5個平皿,每個平皿中加人 1ml樣液,然後用冷卻至45℃左右的熔化的營養瓊脂培養基 15~20ml倒人每個平皿內混合均勻 。待瓊脂凝固後翻轉平皿置 35℃±2℃培養 48h後,計算平板上的菌落數。

B2.2 結果報告

菌落呈片狀生長的平板不宜采用;計數符合要求的平板上的菌落,按式(B1)計算結果:

X1=A×(K÷5)

式中X1—–細菌菌落總數 cfu/g或cfu/mL;

A——5塊營養瓊脂培養基平板上的細菌菌落總數;

K——稀釋度。

當菌落數在 100以內,按實有數報告,大於 100時采用二位有效數字。

如果樣品菌落總數超過本標準的規定,按 B2.3進行複檢和結果報告。

B2.3 複檢方法

將留存的複檢樣品依前法複測 2次,2次結果平均值都達到本標準的規定,則判定被檢樣品合格;其中有任何 1次結果平均值超過本標準規定,則判定被檢樣品不合格。

B3  大腸菌群檢測方法

B3.1 操作步驟

取樣液 5ml接種 50ml,乳糖膽鹽發酵管,置 35℃±2℃培養 24h,如不產酸也不產氣,則報告為大腸菌群陰性。

如產酸產氣,則劃線接種伊紅美藍瓊脂平板,置35℃±2℃培養 18~24h,觀察平板上菌落形態。典型的大腸菌落為黑紫色或紅紫色,圓形,邊緣整齊,表麵光滑濕潤,常具有金屬光澤,也有的呈紫黑色,不帶或略帶金屬光澤,或粉紅色,中心較深的菌落。

取疑似菌落 1-2個作革蘭氏染色鏡檢,同時接種乳糖發醉管,置 35℃±2℃培養 24h,觀察產氣情況。

B3.2 結果報告

凡乳糖膽鹽發酵骨產酸產氣,乳糖發酵管產酸產氣,在伊紅美藍平板上有典型大腸菌落,革蘭氏染色為陰性無芽胞杆菌,可報告被檢樣品檢出大腸杆菌。

B4  綠膿杆菌檢測方法

B4.1 操作步驟

取樣液 5ml,加人到50ml SCDLP培養液中,充分混勻,置 35℃±2℃培養 18~24h。如有綠膿杆菌生長,培養液農麵呈現一層薄菌膜,培養液常呈黃綠色或藍綠色。從培養液的薄菌膜處挑取培養物,劃線接種十六烷三甲基溴化胺瓊脂平板,置 35℃±2℃ 培養 18~24h,觀察菌落特征。綠膿杆菌在此培養基上生長良好,菌落扁平,邊緣不整,菌落周圍培養基略帶粉紅色,其他菌不長。

取可疑菌落塗片作革蘭氏染色,鏡檢為革蘭氏陰性菌者應進行下列試驗:

氧化酶試驗:取一小塊潔淨的白色濾紙片放在滅菌平皿內,用無菌玻棒挑取可疑菌落塗在濾紙片上,然後在其上滴加一滴新配製的 1%二甲基對苯二胺試液,30s內出現粉紅色或紫紅色,為氧化酶試驗陽性,不變色者為陰性。

綠膿菌素試驗:取2-3個可疑菌落,分別接種在綠膿菌素測定用培養基斜麵,35℃±2℃培養24h,加入 3~5ml,充分振蕩使培養物中可能存在的綠膿菌素溶解,待三-氯-甲-烷呈藍色時,用吸管移到另一試管中並加人 1mol/L的鹽酸1mL,振蕩後靜置片刻。如上層出現粉紅色或紫紅色即為陽性,表示有綠膿菌素存在。

硝酸鹽還原產氣試驗:挑取被檢菌落純培養物接種在硝酸鹽脈水培養基中,置 35C12C培養24h培養基小倒管中有氣者即為陽性

明膠液化試驗:取可疑菌落純培養物,穿刺接種在明膠培養基內,置 35℃±2℃培養 24h,取出放於4~10C,如仍呈液態為陽性,凝固者為陰性。

42℃生長試驗:取可疑培養物,接種在普通瓊脂斜麵培養基上,置 42℃培養 24~48h,有綠膿杆菌生長為陽性。

B4.2 結果報告

被檢樣品經增菌分離培養後,證實為革蘭氏陰性杆菌,氧化酶及綠膿杆菌試驗均為陽性者,即可報告被檢樣品中檢出綠膿杆菌 如綠膿菌素試驗陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產氣和42℃生長試驗三者皆為陽性時,仍可報告被檢樣品中檢出綠膿杆菌。

B5 金黃色葡萄球菌檢測方法

B5.1 操作步驟

取樣液 5ml,加入到 50mL SCDLP培養液中,充分混勻,置 35℃±2℃培養 24h,自上述增菌液中取1~2接種環,劃線接種在血瓊脂培養基上,置 35℃±2℃培養24~48h。在血瓊脂平板上該菌菌落呈金黃色,大而突起,圓形,不透明,表麵光滑,周圍有溶血圈。

挑取典型菌落,塗片作革蘭氏染色鏡檢,金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌,排列成葡萄狀,無芽胞與莢膜。鏡檢符合 上述情況,應進行下列試驗:

甘露醇發酵試驗:取上述菌落接種甘露醇培養液,置 35℃±2℃培養 24h,發酵甘露醇產酸者為陽性。

血漿凝固酶試驗:(1)玻片法:取清潔幹燥載玻片,一端滴加一滴生理鹽水,另一端滴加一滴兔血漿,挑:取菌落分別與生理鹽水和血漿混合,5min如血漿內出現團塊或顆粒狀凝塊,而鹽水滴仍呈均勻混濁無凝固則為陽性,如兩者均無凝固則為陰性。凡鹽水滴與血漿滴均有凝固現象,再進行試管凝固酶試驗;(2)試管法:吸取 1:4新鮮血漿 0.5ml,放滅菌小試管中,加入等量待檢菌 24hrou湯培養物 0.55mL,混勻,放 35℃±2℃溫箱或水浴中,每半小時觀察一次,24h之內呈現凝塊即為陽性。同時以已知血漿凝固酶陽性和陰性菌株湯培養物各0.5ml,作為陽性與陰性對照。

B5.2 結果報告

凡在瓊脂平板上有可疑菌落生長,鏡檢為革蘭氏陽性葡萄球菌,並能發酵甘露醇產酸,血漿凝固酶試驗陽性者,可報告被檢樣品檢出金黃色葡萄球菌。

B6 溶血性鏈球菌檢測方法

B6.1 操作步驟

取樣液 5ml加人到 50ml葡萄糖ROU湯, 35℃±2℃培養 24h,將培養物劃線接種血瓊脂平板, 35℃±2℃培養24h觀察菌落特征。溶血性鏈球菌在血平板上為灰自色,半透明或不透明,針尖狀突起,表麵光滑,邊緣整齊,周圍有無色透明溶血圈。

挑取典型菌落作塗片革蘭氏染色鏡檢,應為革蘭氏陽性,呈鏈狀排列的球菌。鏡檢符合上述情況,應進行下列試驗:

鏈激酶試驗:吸取草酸鉀血漿 0.2ml(0.01g草酸鉀加5mL兔血漿混勻,經離心沉澱,吸取上清液),加人 0.8ml滅菌生理鹽水,混勻後再加人待檢菌 24h rou湯培養物0.5ml和0.25%氯化鈣0.25ml,混勻,放 35℃±2℃水浴中,2min觀察一次(一般10min內可凝固),待血漿凝固後繼續觀察並記錄溶化時間。如 2h內不溶化,繼續放置 24h觀察,如凝塊全部溶化為陽性,24h仍不溶化為陰性。

杆菌膚敏感試驗:將被檢菌菌液塗於血平板上,用滅菌鑷子取每片含 0.04單位杆菌膚的紙片放在平板表麵仁,同時以已知陽性菌株作對照,在 35℃±2℃下放置 18~24h,有抑菌帶者為陽性。

B6.2 結果報告

鏡檢革蘭氏陽性鏈狀排列球菌,血平板上呈現溶血圈,鏈激酶和杆菌膚試驗陽性,可報告被檢樣品檢出溶血性鏈球菌。

B7 真菌菌落總數檢測方法

B7.1 操作步驟

待上述生理鹽水樣液自然沉降後取上清液作真菌計數。共接種5個平皿,每個平皿中加人 1ml樣液,然後用冷卻至 45℃左右的熔化的沙氏瓊脂培養基 15 ~25mL倒人每個平皿內混合均勻,瓊脂凝固後翻轉平皿置 25℃±2℃培養 7天,分別於 3,5,7天觀察,計算平板上的菌落數,如果發現菌落蔓延,以前 一次的菌落計數為準。

B7.2 結果報告

菌落呈片狀生長的平板不宜采用;計數符合要求的平板上的菌落,按式(B2)計算結果:

X2=B×(K÷5)

式中X2—–真菌菌落總數,cfu/g或cfu/mL;

B—–5塊沙氏瓊脂培養基平板上的真菌菌落總數;

K—–稀釋度。

當菌落數在 100以內,按實有數報告,大於 100時采用二位有效數字。

如果樣品菌落總數超過本標準的規定,按 B7.3進行複檢和結果報告。

B7.3 複檢方法

將留存的複檢樣品依前法複測 2次,2次結果都達到本標準的規定,則判定被檢樣品合格;其中有任何 1次結果超過本標準規定,則判定被檢樣品不合格。

B8 真菌定性檢測方法

B8.1 操作步驟

取樣液 5mL加入到50mL沙氏培養基中, 25℃±2℃培養 7天,逐日觀察有無真菌生長。 

B8.2 結果報告

培養管混濁應轉種沙氏瓊脂培養基,證實有真菌生長,可報告被檢樣品檢出真菌。


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